Flow cytometry 원리/FACS 원리

Flow cytometry의 기본 원리 1 – 세포 한 개에서의 단백질 발현 정도 측정

Flow cytometry는 한국말로 유세포분석(기법) 또는 유세포분석기(기계)라고 부릅니다. 이름에서 유추할 수 있듯이 이는 두 가지의 핵심 기술이 합쳐진 실험기법입니다. “Flow”라는 부분에서 말하는 기술은 세포를 기계 속으로 한 번에 한 개씩 흘려보내는 기술입니다. “Cytometry”라는 부분은 세포를 분석하는 기술을 의미합니다. 결국 한 번에 한 개의 세포를 흘려보내서 세포 하나씩 분석하는 기술이 Flow cytometry입니다. 이 두가지 기술 중에서 세포를 어떻게 분석하는지에 초점을 맞춰서 설명하고자 합니다.

Flow cytometry에서 세포를 분석하는 기술의 핵심은 형광(Fluorescence)입니다. 형광의 개념은 조금 뒤에 설명하기로 하고, 우선 형광은 색이라고 단순하게 가정해보겠습니다. 따라서 형광항체라고 하면, 이는 색으로 구분될 수 있는 항체를 의미하며, 이 항체는 물론 특이적인 항원에 결합하게 됩니다.

연구하고자 하는 면역세포가 CD4와 CD25라는 두 가지 세포막단백질에 의해 구분이 되고, 내가 관심있는 세포는 CD4+ CD25- 세포 (CD4를 발현하고 CD25를 발현하지 않는 세포) 라고 가정해보겠습니다. 특정 샘플 안에 내가 원하는 CD4+ CD25- 세포가 얼마나 있는지를 알고 싶다면, 샘플을 구성하는 전체 세포의 CD4와 CD25 단백질 발현양상을 우선적으로 측정하고, 그중에서 내가 원하는 세포가 몇 개인지 개수를 세면 됩니다. 따라서 그림. 2와 같이 CD4와 CD25에 각각 결합하는 형광항체로 염색된 세포를 준비하면, 기계는 각 세포에 CD4와 CD25가 얼마나 발현되어 있는지를 각각의 항체 색깔을 읽어냄으로써 분석하게 됩니다 (그림. 2).

 

그림2. Flow cytometry의 기본원리

 

그림2 설명: 세포 표면에 발현하는 CD4와 CD25라는 두 개의 세포막단백질의 발현정도를 눈으로 볼 수 없기때문에 각각을 인식할 수있는 형광항체(Fluorescent antibodies)를 사용하여 각 단백질의 발현 정도를 수치화 할 수있다. 

그림. 2에서의 경우를 본다면 전체 세포 7개 중에서 CD4+ CD25- 세포는 2개이므로, 내가 연구하는 세포는 해당 샘플에서 28.6% 만큼 존재함을 확인할 수 있습니다. 물론 분석하는 세포 개수를 증가시킬 수록 분석의 정확도는 올라갑니다. 이처럼 세포 하나 하나에 특정 단백질(세포막단백질, 싸이토카인, 전자조절인자 등등)이 얼마나 존재하는지를 분석하는 것이 Flow cytometry 기법입니다. Western Blot이 샘플 전체에서 특정 단백질의 양을 비교하는 것이라면, Flow cytometry는 세포 한 개 수준에서의 단백질 양을 비교하는 것이라고 할 수 있습니다.

Flow cytometry의 기본 원리 2 – 형광(Fluorescence)에 대한 이해

학부생 때 수업을 통해 형광의 개념에 대해 배웠던 기억이 납니다. 그런데 당시에는 이론으로만 배우니 감이 잘 오지 않았고, 이후에 직접 형광항체를 가지고 실험을 해보면서 형광에 대해 이해하게 된 경험이 있습니다. 그만큼 어찌 보면 단순히 이론으로만 설명하기엔 어려울 수 있는 개념이 형광이라고 생각됩니다. 실제로 다양한 형광항체를 사용해보면서 어떤 형광물질들이 존재하고, 각 형광물질들은 어떤 특징을 갖는지 익히는 것이 형광에 대한 이해를 높이는 가장 효과적인 방법이라는 생각이 듭니다. 그럼에도 불구하고 이해하기 쉽도록 설명해보겠습니다.

Flow cytometry의 핵심은 결국 항체에 연결된 형광이라고 하는 색을 분별하는 것입니다. 마치 눈으로 다양한 색을 구분해 낼 수 있듯이, Flow cytometry도 다양한 형광이라는 색을 구분해냅니다. 우리가 눈으로 사물의 색을 인식할 때는 광원이라고 하는 외부에서 주어지는 빛이 필요합니다. 예를 들어 태양에서 나오는 가시광선이 사물에 닿고, 사물이 흡수하지 않고 반사하는 특정 파장의 빛을 눈에서 색으로 인식하는 것이죠. 이와 같이 일상생활에서 우리가 눈으로 인식하는 색은 사물이 흡수하지 않고 튕겨내는 빛의 파장입니다. 이러한 이유로 암실에서 붉은 불이 켜졌을 때는 사물에서 반사되는 빛의 종류가 붉은색뿐이므로 모든 사물들이 붉게 보이는 것이죠.

하지만 형광은 조금 다릅니다. 형광물질이라고 말할 수 있는 특정 물질에 “특정 파장”의 빛(에너지)이 주어지면, 형광물질은 자신에게 해당하는 “고유한 파장”의 빛(에너지)을 내보내게 됩니다. 앞서 예를 든 눈으로 사물의 색을 인식하는 경우에서는 사물에 반사되는 빛을 인식하는 것이라서 광원 종류에 따라 사물의 색이 다른 색으로 인식이 되기도 하지만, 형광은 특정 에너지(특정 파장)가 주어졌을 때 형광물질이 스스로 만들어내는 “고유의 색(에너지)”이기 때문에 하나의 형광물질은 늘 “같은 파장”의 빛을 만들어냅니다. (여기서 말한 빛들은 사실 단파장의 빛은 아니고 어느 정도의 스펙트럼을 가지기 때문에 엄격하게 말하자면 제 설명이 틀린 것이지만, 이해를 돕기 위해 이와 같이 설명하였습니다.)

요약하자면 형광물질은 1) 빛을 내기 위해 제공 되어야 하는 에너지(특정 파장의 빛, Excitation spectrum)를 필요로 하며, 2) 그 결과 특정 파장의 빛(Emission spectrum)을 내보냅니다. 이러한 형광의 특징을 활용해 특정 파장의 빛(Laser)을 조사했을 때 해당 형광물질이 발색을 하는지를 (자신만의 고유 파장의 빛을 내보내는지를) 기계가 측정하고, 그 세기를 측정함으로써 특정 형광항체의 존재 및 양 (=항원의 존재 및 양)을 측정하는 것이 Flow cytometry입니다.

 

4. Flow cytometry의 기본 원리 3 – 형광(Fluorescence)의 필수요소 두 가지: Excitation vs Emission spectrum

앞서 살펴본 대로 형광이 빛을 내기 위해서는 적절한 Input이 필요하고, 적절한 Input이 들어오는 경우에 늘 정해진 Output을 냅니다. 그런데 Input과 Output에 해당하는 빛들은 사실 단파장의 빛이 아니고 아니고 특정 스펙트럼의 빛입니다.

 

그림3. FITC의 Excitation/Emission spectrum

 

그림3 설명: FITC에 조사되는 레이저의 파장에 따라 FITC가 내는 형광의 세기가 달라진다.

FITC라고 불리는 형광물질을 예를 들어 설명해보겠습니다. FITC가 활성화돼서 내는 빛은 스펙트럼을 갖지만, 그중에서 약 520 nm 근처 파장의 빛이 가장 세게 측정된다는 것을 그림. 3의 그래프에서 확인할 수 있습니다. 물론 다른 파장의 빛도 검출이 되지만, 520 nm 근처 파장의 빛의 세기가 가장 강하기 때문에, Flow cytometry는 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 때 이를 FITC로 인식합니다. 이처럼 FITC가 방출해내는 빛의 세기를 파장에 따라 그래프로 표현한 것이 FITC의 Emission spectrum 입니다.

그런데 FITC가 가장 효율적으로 강한 형광을 만들기 위해서는 가장 효율적인 Input이 필요합니다. FITC에 가해지는 빛의 파장에 따라 FITC가 만들어내는 빛의 세기는 달라지며, 주어진 빛의 파장에 따라 FITC가 만드는 형광의 세기를 표현한 것이 Excitation spectrum 입니다. 그림. 3의 Excitation spectrum에 다르면 FITC는 495 nm 근처 파장의 빛을 받을 때 가장 밝은 빛을 내지만, 다른 파장의 빛을 받을 때는 만들어내는 형광의 세기가 감소합니다. 예를 들어 430 nm 근처 파장의 빛을 받을 경우 FITC가 만들어내는 형광의 세기가 90% 이상 감소하게 됩니다. 이러한 형광의 특징 때문에 Flow cytometry는 488 nm 파장의 빛을 조사하여 이에 대한 Output으로 515 nm – 545 nm 파장의 빛을 인식할 경우 이를 FITC로 해석하게 됩니다.

각기 다른 여러 파장의 빛을 조사한 뒤 수집되는 빛의 파장을 분석하여 검출된 파장의 빛을 분석하는 것이 Flow cytometry가 색을 인식하는 방법이며, 이러한 원리로 매우 다양한 종류의 형광항체를 구분해낼 수 있습니다 (표. 1).

 

표1. 다양한 Fluorochrome 분석을 위해 사용되는 flow cytometry의 excitation laser 및 detection filter 정보

 

표1. 설명

: 다양한 형광물질들을 각각 다른 최적의 excitation 파장을 갖지만, 각기 다른 파장의 Laser를 쏘기에는 현실적인 어려움이 있다. 따라서 어느정도 절충하여 몇가지의 Laser를 활용해 각각의 형광물질들을 활성화시킨다. 이후에 형광물질로부터 나오는 형광의 특정 파장의 빛만을 측정하기 위해 Filter를 사용한다. Filter정보에서 나오는 앞의 숫자는 Filter가 인식할 수있는 파장의 중간 값이며, 뒤에 나오는 숫자는 Filter의 측정가능 파장의 범위이다.

표에 적힌 Fluorochrome보다 더 많은 Fluorochrome이 있다. 

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2020/06/24 - [전공 공부(생물)/면역학] - Flow cytometry를 이용한 실험들/면역학 실험실